南宫NG28

1.叶绿素荧光丈量有哪些重要技术？有没有哪种仪器能够同时实现这些丈量技术？

答：叶绿素荧光技术有三种重要丈量技术路线：

1)PAM脉冲调造式叶绿素荧光技术：丈量PAM荧光淬灭动力学曲线

2)直接引发式（非调造式）叶绿素荧光技术：丈量OJIP急剧荧光诱导曲线

3)双调造式叶绿素荧光技术：功夫分辨率能够达到1微秒，用于丈量QA-再氧化动力学曲线、S-state、单周转或多周转鼓和光闪急剧荧光动力学等

4)其它叶绿素荧光丈量技术：如激光诱导（LIF）叶绿素荧光丈量、太阳光诱导叶绿素荧光（Solar-induced Chlorophyll Fluorescence，SIF）丈量等（拜见本条后面介绍） 

目前，可能同时实现上述1）至3）三种荧光动力学曲线丈量的仪器只有FL6000双调造叶绿素荧光仪、 FluorCam封关式荧光成像系统和FKM多光谱荧光动态显微成像系统。而由于OJIP急剧荧光动力学曲线和QA-再氧化动力学曲线对技术的特殊要求，对这两种曲线的成像分析更是只有FluorCam封关式荧光成像系统和FKM多光谱荧光动态显微成像系统可能实现。

左图： FL6000双调造叶绿素荧光仪
；中图：FluorCam封关式荧光成像系统
；右图：FKM多光谱荧光动态显微成像系统

超堆集植物鼠耳芥在Cd/Zn处置后的OJIP成像图与OJIP动力学曲线（Morina, 2020）

超堆集植物鼠耳芥在Cd/Zn处置后的PAM荧光淬灭显微成像图与QA-再氧化动力学分析（Morina, 2020）

南宫NG28生态技术公司提供叶绿素荧光技术全面解决规划，除传统的PAM技术、OJIP丈量技术、双调造技术表，还提供叶绿素荧光高光谱成像和激光诱导（LIF）叶绿素荧光高光谱成像技术规划，不仅能够解析植物叶绿素荧光二维异质性散布，还进一步从高光谱纬度解析叶绿素荧光光谱个性，并成像分析Fr（叶绿素荧光红色峰值）、Ffr（叶绿素荧光远红峰值）、Fr/Ffr、F735/F700（与叶绿素浓度呈直线有关）及基于叶绿素荧光分歧峰值（红色峰值Fr和远红峰值Ffr等）的叶绿素荧光参数。LIF叶绿素荧光高光谱成像技术可实现大田叶绿素荧光近地遥感丈量。

左图：叶绿素荧光参数Fr/Ffr成像
；右图：叶绿素荧光光谱（南宫NG28光谱成像与无人机遥感钻研中心提供）

2.丈量叶绿素荧光的光源为什么最好具备两种以上色彩？什么色彩的光源最好？

答：在FluorCam叶绿素荧光成像系统中通常推荐的光源组成是这样的：

5)丈量光：红光

6)光化光：红光+白光或红光+蓝光

7)鼓和脉冲光：白光或蓝光

在脉冲调造技术中，丈量光最重要的作用是丈量最幼荧光F0。而在引发F0时，要求光反映中心不产生电荷分离和热耗散。在引发叶绿素荧光的可见光波段中，红光波长最长，能级最低，可能确保叶绿素分子被引发到较低的引发态。而蓝光等波长较短的光在引发叶绿素荧光时则可能造成热耗散。因而红光最佳的荧光丈量光源。

左：荧光淬灭丈量过程中qN与qP的变动
；右：红光和蓝光引发叶绿素荧光的差距

在光化光和鼓和光的选择上，则重要思考荧光引发效能问题，这与植物/藻类样品中光合色素的吸收光谱是亲昵有关的。如下图可见，红光和蓝光对应叶绿素吸收峰，引发叶绿素荧光效能最高，也可用于钻研植物/藻类对分歧光质的响应。白光是陆续光谱，可仿照天然光，同时两全各类光合色素。红光能级较低，通常不推荐作为鼓和脉冲光源。FluorCam也可定造其他波段光源针对特定样品，尤其是藻类样品，好比590 nm琥珀光、530nm青光、505nm绿光等。

两种或两种以上光化学光的另一个优势是，可进行分歧光质光和效能钻研及光生物学钻研，如下图所示（引自Sander W. Hogewoning等，Blue light dose-responses of leaf photosynthesis, morphology, and chemical composition of Cucumis sativus grown under different conbinations of red and blute light. Journal of Experimental Botany, 2010）

3.FluorCam有哪些PAM脉冲调造丈量职能与参数？

答：FluorCam重要的PAM脉冲调造丈量职能和获得的参数如下：

• ?Fv/Fm：丈量参数蕴含F0，Fm，Fv，Fv/ Fm等

• ?Kautsky诱导效应：F0，Fp，Fv，Ft_Lss，QY，Rfd蹬撰光参数

• ?荧光淬灭分析：F0，Fm，Fp，Fs，Fv，Fv/ Fm，QY，F0’，Fm’，Fv’/ Fm’，NPQ，qP，Rfd，qN，qL等

• ?光响应曲线：F0，Fm，Fv/ Fm，分歧光强下QY，Fv’/ Fm’，NPQ，qP，ETR等

具体参数可参阅下表：

参数符号概想描述

4.重要叶绿素荧光参数的值域领域是几多？互有关系是怎么样的？

答：通常来说，Fm ≥ Fp ≥ Ft ≥ Fs ≥ Fo，Fo’ ≥ Fo，Fm’ ≤ Fm，暗弛豫（actinic light关关后）的Fm ≤ 暗适应的Fm，Fp和Fm’没有严格凹凸关系。

最大光化学效能Fv/Fm或QYmax值域0 – 1。但现实上，在梦想情况下存在上限。：

• ?C3植物：0.83 - 0.84                                 (Bjorkman and Demmig 1987) 

• ?C4植物：0.78                                                 (Pfundel 1998)

• ?藻类：常低于0.7                                         (Trissl and Wilhelm 1993)

这一上限在分歧文件中存在差距，但通常来说，C3植物在尝试中对照组数据要争取大于0.8，最高不能高于0.86。

现实光化学量子效能或量子产额QY或ΦPSII值域0 ? 1，≤ Fv/Fm，通常随Actinic light升高而降低。

Rfd值域为0 ? ∞ ，通常在0 – 6。

qN、 qP、 qL值域为0 – 1。

NPQ值域为0 ? ∞，通常在0 – 4。因而，有的文件中会使用NPQ/4这一参数来对其归一化。

5.FluorCam软件中的荧光参数似乎与文件中的有些差距，通常文件中使用的参数对应FluorCam软件中的哪个参数？

答：软件中为了便于鉴别与分辨，与文件中的通常描述有所差距。通常文件中提到的参数在FluorCam软件中的显示如下：

文件中的参数FluorCam软件中的参数

软件参数后缀L代表光适应过程，D代表暗弛豫过程， ss为steady-state缩写，代表稳态。Lss即为光稳态。

对于光适应前提下的荧光参数，文件中都默认使用的是光稳态时的对应参数。FluorCam软件中出格以Lss后缀加以分辨。而其他的L1、L2、D1、D2等对应的参数则能够表征暗示光适应或暗弛豫从肇始到稳态的变动过程。

在光响应曲线Light Curve丈量中，由于每一个光强梯度均达到光稳态，因而参数后缀均为Lss，分歧数字暗示分歧的光强梯度。

QY在中英文文件中可能会有多种分歧的表述步骤，但现实上其代表的意思是一样的，即光适应下的真实光能转化效能，推算公式也是一样的。 

6.光适应下的最幼荧光F0’是若何丈量的？

答：最幼荧光 F0是在暗适应前提下丈量得到的，这时PSII光反映中心处于齐全盛开状态（qP=1）。而在光适应下PSII光反映中心处于部门关关的状态（0＜qP＜1），这时辰怎么可能丈量最幼荧光呢？

以前，由于技术限度，所有叶绿素荧光仪器都不能直接丈量F0’。1997年，Oxborough和Baker提出了一个F0’的估算公式：

之后的一系列钻研证明，这个公式估算得到的数据是可信的。即便是此刻，大部门没有明确注明的叶绿素荧光仪器依然是使用这个公式进行估算。

但这个数据终于不是直接丈量得到的，在好多光合钻研中是无法代表。随着LED技术的进取，FluorCam则通过建设专用的远红光源板来对F0’进行实测。这是利用了远红光只会引发PSI而不引发PSII的个性。在光适应刚刚实现，光化光关关时，立刻照射远红光，使PQ库氧化，强造PSII达到齐全盛开的状态，从而对F0’进行实测。

从另表一个方面说，没有建设远红光源的叶绿素荧光仪或者荧光成像仪都是不能现实丈量F0’的。同时，有些荧光成像仪即便建设了远红光源，但由于其远红光源没有与PAM脉冲调造丈量法式联动，也不能现实丈量F0’。

7.叶绿素荧光丈量前为何要进行暗适应？必必要进行暗适应吗？

答：暗适应是为了测最大荧光Fm和最幼荧光Fo。

植物/藻类在经过肯定的暗适应后，QA最大水平被氧化，光反映中心齐全“盛开”，此时仪器运行法式则自动发出丈量光，才以测得最幼荧光F0。此丈量光极幼，不能引起光化学反映。也可不进行暗适应直接丈量，运行Fv/Fm法式，丈量得到的QYmax=QY（现实光量子效能）。

8.已经有叶绿素荧光仪了，是否还有必要买叶绿素荧光成像仪？

答：有必要。叶绿素荧光仪为点丈量，获得多多荧光参数值，单次丈量难以反映样品的整体个性，可屡次丈量取均匀值等。比起荧光仪，叶绿素荧光成像仪有以下不成代替的利益：

?数据了局可所以整个样品的均匀值，可反映样品的整体个性，预防样品差距造成的误差
；也能够通过ROI选区工具自动或手动选择分歧区域进行分析

?成像图可能全面反映整株植物、叶片、藻类群体等的分歧地位荧光强度变动与散布，即光合作用生理生态及胁迫的异质性散布状态。

?可丈量叶片、果实、麦穗、大型藻/微藻、整株植物甚至植物冠层等各类样品。

?可同时测定几十、甚至上百株个样品。

?可能在显微水平钻研叶绿体或藻类细胞。

?尤其合用于环境胁迫早期植物分歧部位光合活性的变动法规、突变体分歧部位的光合职能差距等钻研。      

9.叶绿素荧光丈量时若何选择光质？

答：叶绿素荧光丈量重要针对叶绿素a，叶绿素a的两个光谱吸收波峰在蓝紫光波段和红光波段，因而选择蓝光、红光或者白光（复合光）通常均可。其中把稳，蓝藻丈量时尽量选择红光。

10.叶绿素荧光丈量必须在植物活体上丈量吗？

答：准则上，叶绿素荧光丈量因尽量对样品活体原位检测。前提不允许时能够丈量离体叶片，但尽量在活体状态下进行暗适应处置，测试时离体功夫不超过15-20分钟。但具体情况也要看样品在离体后失水影响的具体情况，有些样品则在短时离体后就会萎蔫卷曲，如水稻，而有些样品可耐受长功夫离体，如一些革质叶片。离体检测尽量使用湿纱布等包裹叶梗，如需光下转运可使用两片湿滤纸夹住叶片，预防叶片失水，影响丈量了局。

11.NPQ为负值该当若何解决？

答：通常是丈量参数设置不当造成的，可尝试将鼓和脉冲光适当调大或光化光适当调幼。有些是样品个性造成的，这种情况可尝试更换光质。

12.是否能获得ETR？若何获得ETRmax？

答：叶绿素荧光丈量仪运行LC1~3法式，叶绿素荧光成像运行LightCurve法式，均可获得ETR。ETRmax则需使用sigma plot等工具软件，拟合光响应曲线RLC来获得。（参考文件：Ralph P J, Gademann R. Rapid light curves: A powerful tool to assess photosynthetic activity[J]. Aquatic Botany, 2005,82(3):222-237. 更多参考文件可联系南宫NG28获。

13.叶绿素荧光成像时对样品有何要求？

答：要求样品无任何遮挡，尽量平铺，整株植物成像则最好对统一水平高度的部门进行检测。大型藻可有水湿润但水不要没过样品。布景尽量单纯并且为玄色或者非反光材质。预防使用锡纸、塑料板等反光物品。丈量时通常选用叶片正面，而当叶片背面首先遭逢病虫害时，则也可对背面进行检测。

14.我的分歧处置组样品是分隔成像的，那在写论文时若何将图片放在一路对比？

答：属于统一尝试且必要保留的成像图，必须将其彩色标尺调整为一样的区间。具体步骤如下：

1）点选软件result界面右下方Group color前√ ，统一类参数将使用统一彩色标尺。

2）点选右下方Manual color前√ ，手动设定标尺领域，右键保留成像图。

3）分歧处置样品沉复以上步骤，所有样品统一参数的成图像标尺领域必须设定一致。

4）设定标尺领域的尺度：切合对应参数的理论领域，好比Fv/Fm、QY不超过0-1，NPQ通常不超过0-4等
；为了凸起成像成效，可缩幼标尺领域，但要确保成像图上重要的像素点在这一领域内

15.能够通过FluorCam评估叶绿素浓度吗？

答：有三种步骤能够评估叶绿素浓度：

1）最幼荧光F0、最大荧光Fm和OJIP急剧荧光参数Area都与叶绿素浓杜仔正有关性，有好多有关的文件进行过探求（Chen，2021，2017）。但由于叶绿素荧光参数同时与光合状态有关，因而在使用上应幼心。

2）通过PAR吸收？槭迪。通过这个？檎闪客扑愕腘DVI植被归一化指数，与叶绿素浓度成正有关，这一参数自身就宽泛用于大田遥感普查、丛林生态监测等。同时成像图可能反映叶绿素浓度异质性。

3）通过紫表引发多光谱荧光成像实现。丈量的F690/F740与叶绿素浓度为负有关。目前已有钻研其用于作物氮素营养情况评估。

浙江大学利用FluorCam多光谱荧光成像技术进行油菜氮素营养急剧评估（Sun，2020）

16.在使用FluorCam软件导出数据时，使用Frame numeric还是 numeric average更好？

答：通常，我们建议使用numeric average。以推算Fv/Fm为例，Frame numeric是指先推算每个像素的Fv/Fm，而后再除以像素数求得区域均匀Fv/Fm。而numeric average，则是先获得整个区域的均匀F0、均匀Fm，再以此推算Fv/Fm。若是分析过程中，样本信号强，噪点很少，两种方式的差距不显著。若是样本荧光信号弱，并且存在噪点，则选择numeric average更好。

17.FluorCam显示pixels overflow是什么意思？对数据有何影响？怎么建改？

答：高活络度CCD相机检测荧光的领域为0-4096个单元，高分辨率CCD相机则在0-65536。超出该信号就会警示pixels overflow即信号溢出。在起头尝试丈量前，您必要在live窗口调整shutter和sensitivity，以及设置适合的光强。在打开flash情况下调整shutter和sensitivity使暗适应后的样品荧光值处于较低数值（此时显示的荧光值其实F0）。我们通常建议高活络度CCD相机设置到500-1000，高分辨率CCD相机设置到5000-10000。分歧的植物必要分歧的设置，建议预尝试摸索。

18.Shutter和sensitivity若何影响成像质量？为了获得最佳成效，建议哪些组合设置？

答：具体的设置步骤参考说明书。简短来说，shutter即快门功夫，同时还节造丈量光的持续功夫，通常不超过20或30ms ，sensitivity即活络度。两者越高，荧光信号值越高，太高则超出正常F0的领域。Shutter通常建议设置10-20us，最大不超过33us。Sensitivity越高信噪比越低，建议通常不超过50％。

19.盐胁迫水稻幼苗非光化学荧光淬灭成像：视频中动力学曲线随着胁迫加沉而上升说了然什么，还有怎么去分析此类型的动力学曲线？

答：动力学曲线随胁迫加沉上升通常是由于胁迫导致PSII光化学反映活性降低，光能转化效能低，更多的光能以荧光的大局消散，所以导致荧光信号加强。

荧光动力学曲线的分析通常有两种方式：一是比力分歧样品在暗适应-光适应-暗弛豫3个阶段的荧光强度变动的差距，调查PSII对光强变动的适应性和可塑性以及每个阶段的PSII的活性及电子传递情况。分析了局都是定性描述，定量分析仍需借助推算值
；另表一种分析方式是将动力学曲线上的特点性荧光强度（如Fm_Ln，n代表第几次脉冲）作为变量，和推算值（如Fv/Fm）一路输入到数学模型中，从而筛选出可能反映胁迫水平的特点参数。后者可参考以下论文：

龙燕, 马敏娟, 王英允,等. 利用叶绿素荧光动力学参数鉴别苗期番茄干旱胁迫状态[J]. 农业工程学报, 2021, 37(11):8.

20.叶绿素荧光丈量技术与光合仪的区别？

答：两者都是钻研植物和藻类光合作用的有效工具，但是侧沉分歧。

光合仪重要丈量植物的宏观参数，如光合速度、蒸腾速度、气孔导度、胞间CO2浓度等，以评估衡量植物光合作用的强度和能力，并标配或可选配微气象节造如光、温、湿、CO2？。

叶绿素荧光不仅能反映光能吸收、引发能传递和光化学反映等光合作用的原初反映过程，并且与电子传递、质子梯度的成立及ATP合成和CO2固定等过程有关，是钻研植物光合作用的“探针”。

两者结合丈量在植物光合生理钻研中能够有效互补，可宽泛利用于衡量植物成长情况，分歧胁迫处置对植物光系统的影响，评价生态系统碳出入与全球气象变动的互有关系，植物光系统对全球变动响应等方面。

21.蓝藻光合参数的测定

答：由于蓝光无法引发蓝藻PSII重要的天线色素藻胆素，只能引发叶绿素，而蓝藻中PSI中的叶绿素要多于PSII，这会使PQ库部门氧化，所以必要选择蓝光以表的引发光源，如UV365nm、cyan470nm、green530nm、orange625nn。